Введение в ионообменную хроматографию (ИОХ)

Описание: 0:00–0:50 | Что такое ионообменная хроматография (ИОХ)?

0:50–3:03 | Как работает ИОХ?
3:03–4:24 | Рабочий процесс ионообменной хроматографии
4:24–5:38 | Каковы плюсы и минусы ИОХ?

Ионообменная хроматография (ИОХ) предназначена для очистки белков по их заряду. Чистые белки жизненно важны для успешных экспериментов. Ионообменная хроматография разделяет белки (или любые биомолекулы) на основе разницы в их суммарном заряде при определённом значении pH. Заряд белка зависит от количества и типа ионизуемых аминокислотных боковых групп. У каждого белка есть изоэлектрическая точка (pI), которая соответствует значению pH, при котором его суммарный заряд равен нулю. (Если вас смущает понятие изоэлектрической точки, у меня есть видео на эту тему, ссылка на которое есть в конце этого видео). Короче говоря, если pH среды ниже pI, белок заряжен положительно, а если выше pI, белок заряжен отрицательно.

Перед проведением ионообменной хроматографии необходимо понять два фундаментальных понятия.

1. В буферном растворе, при pH ниже pI белка, белок заряжен положительно, или протонирован, и будет связываться с отрицательно заряженными функциональными группами катионообменной смолы.

2. В буферном растворе, при pH выше pI белка, белок заряжен отрицательно, или депротонирован, и, следовательно, будет связываться с положительно заряженными функциональными группами анионообменной смолы.

Причина этого связана со структурой белков и, как следствие, аминокислот, а также с тем, как они принимают или отдают протоны. Это подробно объясняется в моем видео об изоэлектрической точке.

Ещё один важный инструмент для понимания принципа работы ионообменной хроматографии — это гранулы ионообменной смолы. Ионообменные смолы содержат заряженные функциональные группы, связанные с гранулами смолы, которые имеют положительный или отрицательный заряд. Эти смолы называются катионообменными (+) или анионообменными (-) смолами в зависимости от того, заряжены ли они отрицательно или положительно. Они могут быть как слабыми, так и сильными, в зависимости от используемых функциональных групп.

Представьте себе кошку и овцу, идущих по травянистому полю. (В данном случае кошка — это более отрицательно заряженный белок, овца — более положительно заряженный белок, а травянистая область — это отрицательно заряженные анионообменные смолы). Овца будет постоянно отвлекаться на вкусную траву, останавливаться и постоянно есть, в то время как кошка продолжит идти. Если мы измерим, какое расстояние она прошла за 10 минут, кошка, вероятно, прошла гораздо больше, чем овца. (Если только кошка не решит просто погреться на солнышке, конечно…) Аналогичным образом, белки, обладающие наибольшим электромагнитным притяжением к окружающим гранулам смолы, будут двигаться медленнее всего.

Давайте рассмотрим рабочий процесс ионообменной хроматографии. В этом примере колонка для ионообменной хроматографии заполнена анионообменными смолами или отрицательно заряженными смолами. Следовательно, чем более положительно заряжен белок, тем сильнее он притягивается к этим частицам и тем медленнее он будет двигаться.

1. Вставьте образец в колонку.
2. Белки собираются в верхней части колонки.
3. Различные белки разделяются друг с другом в зависимости от заряда.
4. Белки можно собирать в порядке заряда от отрицательного к положительному.
5. Элюирование можно использовать для ускорения сбора белка, который сильнее всего притягивается к отрицательно заряженным частицам.

Это может быть солевой раствор, который разрушает притяжение между нашим белком и отрицательно заряженными частицами, эффективно вытесняя белок, позволяя ему продолжать движение по колонке.